Bioluminiscencia

por | 23 mayo, 2018

El uso de parásitos vivos modificados genéticamente para el cribado masivo de drogas tiene evidentes ventajas sobre los métodos clásicos de tinción y recuento, que son muy laboriosos y lentos. Los parásitos modificados – fluorescentes o luminiscentes – que no hayan perdido la virulencia como consecuencia de la manipulación genética, constituyen una alternativa ventajosa para ser usados en condiciones de HTS. En este sentido, la bioluminiscencia tiene ciertos inconvenientes con respecto a la fluorescencia: i) las proteínas bioluminiscentes necesitan la adición de un sustrato emisor de luz específico, caro y con una pobre penetración en las células diana; ii) las placas o tejidos deben fijarse con el fin de grabar la señal, que junto con su corta vida media hace que sea inservible para obtener mediciones repetidas de la misma muestra. Por su parte la fluorescencia cubre la totalidad del espectro de luz visible – incluido el infrarrojo cercano – lo que nos permiten seleccionar la longitud de onda que mejor se ajusta a nuestro modelo experimental. Además, los marcadores fluorescentes permiten usar varias proteínas simultáneamente sin interferencia entre ellas, por lo que se hace factible el estudio de diferentes interacciones moleculares y/o celulares in vitro. Sin embargo, la fluorescencia no está desprovista de inconvenientes: i) la exposición de las células a ciertas longitudes de onda de excitación puede perturbar las funciones celulares normales; ii) la baja penetrabilidad de la emisión fluorescente la hace inapropiada, al día de hoy, para los estudios in vivo con patógenos que colonicen órganos internos del animal.

Precisamente es el uso de los parásitos transgénicos en los estudios preclínicos in vivo el que genera mayores controversias sobre su adecuación. Lo primero, como ya se ha comentado antes, la cepa manipulada genéticamente debe conservar intacta su virulencia respecto a la original. Este punto está perfectamente solventado como se verá más adelante. En segundo lugar, el modelo animal de la enfermedad que se quiera estudiar. Para las infecciones que afectan a órganos internos, las proteínas bioluminiscentes son instrumentos más sensibles y precisos que las proteínas fluorescentes ya que permiten distinguir entre los procesos inflamatorios asociados con una infección y la carga parasitaria. Multitud de estudios han demostrado que la emisión de luz de la luciferasa tiene una penetración más profunda en los tejidos que la fluorescencia. Los parámetros principales para formación de imágenes in vivo son la fotoestabilidad, la penetración de la luz, el brillo y la relación señal-ruido. A pesar de que la bioluminiscencia tiene mejor contraste que la fluorescencia, la emisión fluorescente es más brillante, lo que permite tiempos de adquisición menores (200-300 ms para las proteínas fluorescentes vs. 5-10 min para las luminiscentes), reduciendo drásticamente la cantidad de ruido adquirida. Sin embargo, a pesar de esta superioridad de la bioluminiscencia en la detección cuantitativa de patógenos en órganos internos, no se debe olvidar la administración obligada del sustrato emisor de luz que es caro, requiere de administración endovenosa y tiene una vida media de emisión de luz corta. Estos problemas no ocurren con las infecciones cutáneas de estas enfermedades. La superficialidad de las mismas – almohadilla plantar de las patas traseras o el dorso de la oreja de ratones – permite el seguimiento de la emisión de diferentes proteínas fluorescentes. Esto proporciona un considerable ahorro de material, así como contribuye a una reducción significativa de la manipulación traumática de los animales.

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